捕集離子淌度質(zhì)譜帶來磷酸化蛋白質(zhì)組研究新的深度
Yasushi Ishihama 教授
京都大學(xué)分子與細(xì)胞生物分析實(shí)驗(yàn)室
2021年1月發(fā)表于www.ddw-online.com
目前，在蛋白質(zhì)生物化學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)相關(guān)研究中，質(zhì)譜（MS）已廣泛應(yīng)用于鑒定和表征蛋白質(zhì)。且隨著技術(shù)的不斷發(fā)展，質(zhì)譜已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了更高的覆蓋深度、更快的分析速度和更高的靈敏度。例如，串聯(lián)質(zhì)譜（MS/MS）是一種靈敏、準(zhǔn)確、有效的檢測手段，通過產(chǎn)生并檢測序列特異性碎片離子1對肽段進(jìn)行解析。同時(shí)，相較于傳統(tǒng)的PTMs分析方法，如埃德曼降解法、氨基酸分析法、同位素標(biāo)記法、免疫化學(xué)法等，存在如氨基酸序列覆蓋不完整，對不同PTMs的串?dāng)_、選擇性及其對細(xì)胞調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的影響等諸多問題。串聯(lián)質(zhì)譜也可作為解析蛋白質(zhì)翻譯后修飾（PTMs）的有效工具，用于闡明控制細(xì)胞活動(dòng)的復(fù)雜過程，如細(xì)胞分裂、生長和分化。
在可逆PTM中，蛋白質(zhì)磷酸化為最主要的形式之一，用以調(diào)節(jié)細(xì)胞重要的代謝、激素、發(fā)育和應(yīng)激反應(yīng)，因此，在細(xì)胞的蛋白質(zhì)合成、細(xì)胞分裂、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞生長、發(fā)育和衰老2過程中，起著至關(guān)重要的作用。磷酸化水平異常會(huì)導(dǎo)致如癌癥和糖尿病等一系列疾病，因此，磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)成為了探索健康和疾病密碼的重要工具。在細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)中，可逆磷酸化是將信號轉(zhuǎn)導(dǎo)到細(xì)胞核以控制基因表達(dá)的其中一項(xiàng)關(guān)鍵因子。此前研究學(xué)者估計(jì)人體內(nèi)約有30%的蛋白質(zhì)被磷酸化，但京都大學(xué)分子和細(xì)胞生物分析實(shí)驗(yàn)室的研究人員開發(fā)了一種高選擇性的磷酸肽富集方法，并將該方法應(yīng)用于檢測細(xì)胞磷酸化，研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)：人體內(nèi)至少有70％的蛋白質(zhì)被磷酸化，超出了原先的預(yù)估3,4。
圖1：Swiss-prot中各種PTMs統(tǒng)計(jì)概覽（參考文獻(xiàn)：Khoury, G., Baliban, R. & Floudas, C. Proteome-wide post-translational modification statistics: frequency analysis and curation of the swiss-prot database. Sci Rep 1, 90 (2011)）
捕集離子淌度質(zhì)譜已經(jīng)成為磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)研究最強(qiáng)大的工具
隨著技術(shù)的進(jìn)步，人們逐漸在磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)方法中使用質(zhì)譜技術(shù)來研究蛋白質(zhì)磷酸化。通過對蛋白質(zhì)和PTM的深入表征和定量分析，人們發(fā)現(xiàn)，理解蛋白的信號傳導(dǎo)途徑和異常疾病狀態(tài)至關(guān)重要。高分辨質(zhì)譜儀的發(fā)展和專為蛋白質(zhì)磷酸化整體分析量身定制的磷酸化肽富集技術(shù)，為分子和細(xì)胞生物學(xué)家研究蛋白信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑提供了強(qiáng)大的工具。盡管人們已經(jīng)取得了一些進(jìn)展，但與未修飾的肽段檢測相比，識(shí)別PTM仍是一項(xiàng)挑戰(zhàn)。由于PTM蛋白通常以低豐度形式出現(xiàn)，并且不同蛋白質(zhì)磷酸化的差異極大（跨多個(gè)數(shù)量級），由此推動(dòng)了人們對更高靈敏度、更高峰容量檢測儀器的需求。
離子遷移譜（IMS）是一種氣相后電離分離方法，當(dāng)與質(zhì)譜結(jié)合使用時(shí)，可基于結(jié)構(gòu)（離子構(gòu)象）和質(zhì)荷比（m/ z）對分析物進(jìn)行快速、高分辨率的分離5。IMS-MS是一項(xiàng)完善的技術(shù)，在蛋白質(zhì)分析方面已顯示出巨大的潛力，他可以提升多肽的鑒定質(zhì)量，提供與LC-MS質(zhì)量信息互補(bǔ)的結(jié)構(gòu)信息。IMS-MS根據(jù)離子的形狀（IMS）和質(zhì)量（MS）的差異來分離離子，從而傳遞離子的三維（3D）結(jié)構(gòu)信息。這種通過構(gòu)象差異分離離子的能力使得人們分離同分異構(gòu)體成為可能，例如磷酸肽位置異構(gòu)體（即肽段中磷酸化數(shù)目相同，但位點(diǎn)不同），而傳統(tǒng)質(zhì)譜技術(shù)很難將它們區(qū)分6。
2017年，通過特定質(zhì)量和遷移率的離子累積和聚焦的離子淌度技術(shù)，即捕集離子淌度（TIMS）技術(shù)被引入蛋白質(zhì)組學(xué)，這使蛋白質(zhì)分析的靈敏度和速度有了更進(jìn)一步的革命性增長。TIMS能夠以毫秒為單位，在氣相中以高效、短循環(huán)周期和高分辨率特性對離子遷進(jìn)行淌度分析，并且使用測量其碰撞截面積（CCS）7，并將CCS值用于蛋白質(zhì)組學(xué)工作流程中，從而產(chǎn)生了由質(zhì)量、強(qiáng)度、保留時(shí)間和CCS的4D-蛋白質(zhì)組學(xué)方案。
TIMS通常與飛行時(shí)間質(zhì)譜（TOF）結(jié)合使用，以達(dá)到更高的分析速度。結(jié)合平行累積連續(xù)碎裂（PASEF）技術(shù)，TIMS-QTOF MS系統(tǒng)可以提供更高速、更高靈敏度的檢測方法。新穎的設(shè)計(jì)使離子可以在系統(tǒng)前部淌度分析器進(jìn)行離子的累積和聚焦，而后部淌度分析器則根據(jù)其離子遷移率，透過調(diào)控電場將離子依次釋放。TIMS與PASEF的強(qiáng)大結(jié)合可在少量樣品情況下，實(shí)現(xiàn)更大的磷酸化蛋白質(zhì)組覆蓋率，并且通過使四級桿與TIMS，在特定肽段的洗脫時(shí)間內(nèi)，提供>100Hz的測序速度而不損失靈敏度或分辨率。
圖2：捕集離子淌度用于磷酸化修飾位點(diǎn)區(qū)分
例如，京都大學(xué)的研究小組發(fā)現(xiàn)PASEF可以有效地提高串聯(lián)質(zhì)譜的采集速率，從而達(dá)到磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)研究新深度，提高鑒定結(jié)果的可靠性。PASEF采集模式的高速度和高靈敏度也有助于TIMS-QTOF MS實(shí)現(xiàn)高通量分析。這種優(yōu)勢對宏蛋白質(zhì)組學(xué)的相關(guān)研究極為重要，如分析大量樣品以在蛋白質(zhì)組水平上研究人類和細(xì)菌之間的相互作用。下一步便是在現(xiàn)有的代謝蛋白質(zhì)組學(xué)研究中利用PASEF的高速采集模式，找尋與疾病相關(guān)的潛在生物標(biāo)志物8。
捕集離子淌度質(zhì)譜用于激酶信號轉(zhuǎn)導(dǎo)研究
激酶信號是通過可逆酶促反應(yīng)在底物上加上磷酸基團(tuán)產(chǎn)生的，是細(xì)胞活動(dòng)的重要組成部分，詳細(xì)研究激酶信號過程對于理解眾多疾病和開發(fā)新療法至關(guān)重要9。激酶介導(dǎo)的磷酸化信號通路是已知導(dǎo)致或驅(qū)動(dòng)如癌癥等疾病發(fā)展的重要因素。京都大學(xué)的研究小組已經(jīng)開發(fā)了磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)方法，對激酶靶向藥物的體內(nèi)磷酸化蛋白質(zhì)組分析，其目的是促進(jìn)癌癥治療藥物的發(fā)現(xiàn)和開發(fā)，進(jìn)而探索、分析磷酸化分子的功能。因此，TIMS-QTOF-MS在藥物發(fā)現(xiàn)中，特別是在與癌癥相關(guān)的磷酸化方面具有重要意義。目前，人們已經(jīng)開發(fā)出許多抑制特定激酶的藥物。迄今為止，已有超過19000種針對約260種蛋白激酶的激酶抑制劑被報(bào)道10，約30種小分子激酶抑制劑已被美國食品和藥物管理局（FDA）批準(zhǔn)用于臨床11。
京都大學(xué)的研究小組通過使用timsTOF Pro（布魯克）實(shí)現(xiàn)1分鐘梯度洗脫，并將其用于研究激酶抑制劑的作用機(jī)制（圖3）。這項(xiàng)工作希望通過實(shí)驗(yàn)和計(jì)算，將激酶與其底物相結(jié)合，以揭示整個(gè)信號網(wǎng)絡(luò)。
圖3：帶有timsTOF Pro的毛細(xì)管LC 1分鐘梯度，100 s/run，864 run/d TIC =總離子色譜圖；XIC =提取離子色譜圖。
在過去的20年里，基于質(zhì)譜的磷酸化蛋白研究已被應(yīng)用于許多大規(guī)模分析細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的研究中?，F(xiàn)在，基于LC-MS/MS12,13上進(jìn)行的激酶組研究，研究人員現(xiàn)在正在達(dá)到只有使用TIMS-QTOF MS才能達(dá)到的通量水平。
持續(xù)的技術(shù)創(chuàng)新推進(jìn)蛋白質(zhì)組學(xué)研究
顯然，基于質(zhì)譜的蛋白質(zhì)組學(xué)研究的發(fā)展（如使用TIMS技術(shù)的4D-蛋白質(zhì)組學(xué)），已經(jīng)讓研究人員在高通量、高靈敏度條件下深入了解分子和細(xì)胞功能。特別是使用PASEF采集法提供的超快分析速度和超高靈敏度，在低樣本量條件下就能達(dá)到鳥槍蛋白質(zhì)組學(xué)和磷酸蛋白質(zhì)組學(xué)研究新深度。這種4D-蛋白質(zhì)組學(xué)方法將使科學(xué)家能夠在常規(guī)情況下探索以前無法獲得的蛋白質(zhì)信息。
各種計(jì)算蛋白質(zhì)組學(xué)的方法推動(dòng)了蛋白質(zhì)組學(xué)的未來發(fā)展，數(shù)據(jù)非依賴型采集（DIA）方法是基于質(zhì)譜技術(shù)的磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)的重要進(jìn)展。DIA是近來較新開發(fā)的一種質(zhì)譜采集技術(shù)，相比于數(shù)據(jù)依賴型采集（DDA），DIA以連續(xù)、無偏的方式對特定質(zhì)量范圍內(nèi)的所有前體離子進(jìn)行MS2掃描。二代測序（NGS）技術(shù)與蛋白質(zhì)組學(xué)的結(jié)合，在蛋白質(zhì)基因組學(xué)等多組學(xué)領(lǐng)域，尤其是腫瘤臨床研究中得到了廣泛應(yīng)用14。
通過將DIA與PASEF相結(jié)合，研究人員可以通過TIMS和m/Z雙重隔離模式來彌補(bǔ)傳統(tǒng)的DIA缺陷（圖4）。在dia-PASEF方法中可以大大增加離子利用百分比（對于低復(fù)雜度樣品能達(dá)到100%，對于高復(fù)雜度的樣品，仍然比使用類似隔離模式大小和m/z范圍的傳統(tǒng)DIA方法高5倍）。這可以縮短dia-PASEF采集的循環(huán)時(shí)間，使其與短梯度分離兼容，又能保持高選擇性。受益于TIMS空間聚焦效應(yīng)，dia-PASEF不僅提高了檢測靈敏度，在全面4D-蛋白質(zhì)組學(xué)支持下，可以將DIA選擇性提高到一個(gè)新水平。
圖4：dia-PASEF窗口分配示例。使用25Da寬的64個(gè)窗口，1.7秒循環(huán)時(shí)間dia-PASEF方法。此方法使用6.25％的離子，等效的3D DIA方案僅使用1.25％。
在過去的二十年中，質(zhì)譜技術(shù)和新方法（例如TIMS，PASEF和dia-PASEF）已取得了重大進(jìn)展，并將磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)轉(zhuǎn)變?yōu)榈鞍踪|(zhì)研究者、生物學(xué)家和臨床研究人員尋求對蛋白質(zhì)和細(xì)胞信號的更深入了解，并將其轉(zhuǎn)化為疾病轉(zhuǎn)化模型的強(qiáng)大工具。
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400-6699-117 轉(zhuǎn) 2005
